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      前沿科技| 氨甲酰磷酸不同合成途徑在大腸桿菌中的比較!

      來源:國環檢測 日期:2019-11-08 22:27 點擊量:
        氨甲酰磷酸的合成具有極為重要的意義,本研究以大腸桿菌為材料,建立了細胞水平的氨甲酰磷酸檢測體系。在此基礎上,對氨甲酰磷酸合成的CPSⅡ途徑與CK途徑在全細胞催化水平進行了相應的比較和優化。優化后的CPSⅡ途徑合成氨甲酰磷酸的能力優于CK途徑,這為相關高附加值化合物的合成提供了一種更加高效的策略。

        1、背景

        氨甲酰磷酸是生物合成代謝中精氨酸與嘧啶的重要前體物質,在工業微生物生產精氨酸與嘧啶及其衍生物中發揮關鍵作用。

        2、目的

        在大腸桿菌Escherichia coli BW25113中比較氨甲酰磷酸不同合成途徑的催化效率。

        3、方法

        在大腸桿菌Escherichia coli BW25113中過表達鳥氨酸氨甲?;D移酶(OTC)的基礎上,分別過表達大腸桿菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPSⅡ)并表征其反應效果。通過優化底物供應(調整底物濃度與引入L-谷氨酰胺合成酶)對CK與CPSⅡ的催化反應進行優化。

        4、結果

        在大腸桿菌中過表達OTC,建立細胞水平氨甲酰磷酸檢測體系。在此基礎上比較不同來源的CK,發現大腸桿菌來源的CK效果最好,50 mmol/L NH4HCO3條件下全細胞催化9 h得到2.95±0.15 mmol/L L-瓜氨酸;過表達CPSⅡ時,50 mmol/L L-谷氨酰胺催化9 h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通過改變底物NH4HCO3濃度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式對CK與CPSⅡ的催化反應分別進行優化后,100 mmol/L NH4HCO3條件下,L-瓜氨酸濃度分別提高至4.67±0.55 mmol/L和6.12±0.38 mmol/L,且過表達GS后CPSⅡ途徑可以利用NH3,不需要額外添加L-谷氨酰胺。

        5、結論

        【結論】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPSⅡ途徑合成氨甲酰磷酸的能力優于CK途徑,為精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一種更加高效的策略。


        圖1氨甲酰磷酸的不同合成途徑與L-瓜氨酸合成途徑


        圖2 SDS-PAGE分析不同來源CK的蛋白表達(A)與催化能力比較(B)

        

        圖3 SDS-PAGE分析CPSⅡ的蛋白表達(A)與催化效果(B)

       

        圖4 NH4HCO3濃度對菌株ECFI合成氨甲酰磷酸的影響

        

        圖5引入兩岐雙岐桿菌來源GS對CPSⅡ途徑的影響(A),以及降低L-谷氨酰胺添加量對菌株GSABFI的影響(B)


        圖6兩種合成氨甲酰磷酸途徑的比較
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